微生物组学研究的相关概念

这篇文章主要对微生物组学研究中常出现的概念进行整理，

资料摘抄原文如下：

微生物组学的常见分类

建立在高通量测序基础上的微生物群落研究，当前主要有三大类：

基于16S/18S/ITS等扩增子做物种分类的Metataxanomics、
鸟枪法打断全基因组DNA序列的Metagenomics
和基于mRNA信息的宏转录组方法Meta-transcriptomics。

###16S/18S/ITS扩增子测序

16S rDNA是细菌分类学研究中最常用的“分子钟”，其序列包含9个可变区（Variable region）和10个保守区（constant region）。可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。通过检测16S rDNA的序列变异和丰度，可以了解环境样品中群落多样性信息。基于16S rDNA的分析在微生物分类鉴定、微生态研究等方面起到重要作用。

16S rDNA结构：16s rRNA基因的序列（约1500bp）有10个保守区和9个高变区（v1-v9：长度分布范围约30~100bp）之分；保守区为所有细菌共有，细菌间无差别，能反映生物物种的亲缘关系，可变区具有属或种的特异性，序列则随菌间的亲缘关系不同而有一定的差异，所以能揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标。根据保守区设计引物位点，扩增可变区获得的序列可以用于菌种鉴定。一种快速、廉价的菌种鉴定方法。

16s rRNA基因可变区考虑因素：

16s rRNA基因数据库

SILVA; GreenGenes, RDP, EzTaxon-e

几个概念：

核糖体：Ribosome，由 RNA(rRNA）和蛋白质组成，配合 tRNA 来翻译 mRNA。核糖体按沉降系数来分类，S就是沉降系数，原核70S，真核80S。我们一般研究微生物，70S，由50S和30S两个亚基组成。再细分为 5S、16S、23S，我们的 16S 就是指核糖体的亚基的一个组分，16S rRNA。（记住，这是原核生物核糖体的一个组分）

16S rRNA：这并不是我们的研究对象，因为我们测序的不是它，而是它对应在DNA双链上的基因序列，

16S rDNA。可以这样理解，我们所说的16S 就是指 16S rDNA。

分子钟：即氨基酸在单位时间以同样的速度进行置换。16S 的进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝，5S、16S、23S rDNA的拷贝数相同。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。（来源百度）

OTU：即Operational Taxonomic Units的缩写（千万表手滑写成OUT，否则就OUT了），在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，属，种、分组等）设置的同一标志。理论上一个OTU代表一个微生物物种。

通过测序获得的大量reads，如何才能转变为我们需要的物种信息呢？首先需要对这些reads进行归类（cluster），通常在97%的相似水平划分为不同的OTU，将OTU代表序列与相应的微生物数据库比对（Silva、RDP、Greengene等），得到每个样本所含的物种信息，进而进行后续生物信息统计分析。

Alpha多样性：用于度量群落生态单样本的物种多样性，是反映丰富度和均匀度的综合指标。

菌群丰富度（Community richness）指数有：Chao、Ace，Chao或Ace指数越大，说明菌群丰富度越高。

菌群多样性（Community diversity）指数有：Shannon、Simpson，Shannon值越大，说明群落多样性越高；Simpson指数值越大，说明菌群多样性越低。

根据各样本生成的OTU，对样本序列进行随机取样，以取出的序列数及这些序列所能代表的OTU数构建曲线，计算样本的Alpha多样性。

Beta-diversity： Beta多样性用于不同生态系统之间多样性的比较，利用各样本序列间的进化关系及丰度信息来计算样本间距离，反映样本（组）间是否具有显著的微生物群落差异。目前应用比较多的是PCA、PCoA、NMDS分析等。由于微生物多样性研究通常会涉及到大样本数量的样本，因此通过Beta-diversity分析可以直观地反映样本组间的差异情况。距离越远，微生物群落差异越大，即相似性越高。

LEfSe
LEfSe分析即LDA Effect Size分析，多用于多个分组（≧2）之间的比较，或者进行亚组比较分析，进而找到组间在丰度上有显著差异的物种（biomaker）。

基本过程是首先在多组样本中采用非参数因子Kruskal-Wallis秩和检验检测不同分组间丰度差异显著的物种；然后基于获得的显著差异物种，利用成组的Wilcoxon秩和检验进行组间差异分析；最后采用线性判别分析（LDA）对数据进行降维并评估差异显著的物种的影响力大小（即LDA score）。

18S rDNA或ITS（Internal Transcribed Spacer）被广泛应用在真菌分类鉴定中。18S rDNA在系统发育研究中较适用于种级以上阶元的分类；ITS属于中度保守区域，利用它可研究种及种以下的分类阶元。

局限性

16S虽然是一种相对快速和经济适用的方法，但是PCR导致了偏好的产生，这就降低了注释准确度。此外，由于原核、真核生物的“分类标签”完全不同，即使细菌和古菌的16S也相去甚远，以进化快著称的病毒更难以捕获。

常规分析流程

下机数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的Clean data方可用于后期分析；通过reads之间的Overlap关系将reads拼接成Tags；在给定的相似度下将Tags聚成OTU，然后通过OTU与数据库比对，对OTU进行物种注释；基于OTU和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析。

宏基因组

宏基因组有效避免了扩增偏差，由于是直接打断，理论上不限制物种（细菌、真菌、古菌、真核生物等，事实上当前宏基因组测序多还是以细菌为主），可能组装获得新基因乃至新物种信息，但根据取样情况可能存在少量或大量的宿主污染，因需组装，数据量要求大，成本贵、周期长。

宏基因组经典流程：环境微生物样本–Total DNA提取–文库构建–上机测序（经典短读长: illumina系列；长读长选择: PB, ONT）–数据质控（去除低质量和接头等，去除宿主基因组等干扰信息）–宏基因组组装–Contig Binning–基因组重建–分类注释（可基于reads、contig、bins、还原出来的基因组做物种注释）–其他下游分析。

宏转录组

宏转录组的好处是，跳出了DNA层面的束缚，可以获得实时活跃的、真正对群落有贡献的基因和通路，然而mRNA不如DNA稳定,此外多纯化和扩增的步骤也可能引入错误。

宏转录组也迎来了自己的专属软件–IMSA+A ( https://github.com/JeremyCoxBMI/IMSA-A )。IMSA+A在17年1月发表于Microbiome，是一种可应用于任意读长宏转录组学数据、可高效在同一份样品中鉴定出细菌、真菌、病毒的准确的分类分析的方法。