scRNA-seq数据预处理

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scRNA-seq的上游处理与bulk RNA-seq有相似的地方，也有不同的地方。相似的地方如：对原始数据的质控检测、去除低质量的reads、adpter、比对。不同的地方如scRNA-seq数据有的需要考虑Demultiplexing。而且scRNA-seq根据采用的不同的protocols，产生的数据和处理方法也有不同。

这里提供的练习数据是SMART-seq2建库，SMRT-seq2建库的测序数据上游分析与bulk RNA-seq相似，如这节课内容中的分析方法：

  • FastQC 对原始数据进行质控检测
  • Trim Galore 质控
  • STAR或Kallisto比对

练习数据

mouse ESC的单细胞数据(Kolodziejczyk et al. 2015)，数据下载位置：https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-2600/samples/

直接点击下载按钮即可下载fastq的数据。

  • ERR522959_1.fastq
  • ERR522959_2.fastq

质控

  • FastQC
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mkdir fastqc_results
fastqc -o fastqc_results Share/ERR522959_1.fastq Share/ERR522959_2.fastq
  • Trim galore 是一个自动识别adpter的质控软件
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mkdir fastqc_trimmed_results
trim_galore --nextera -o fastqc_trimmed_results Share/ERR522959_1.fastq Share/ERR522959_2.fastq

Demultiplexing

不同的protocol和pipeline决定了demultiplexing的方法也不同，最灵活的方法是zUMI,可以用于大多的demultiplexing和基于UMI的protocols。SMARTseq2直接提供的是已经demultiplexing的数据。

如何理解demultiplexing？

demultiplexing的过程即识别并移除cell barcode序列。

scRNA-seq质控中需要考虑的另一个因素是不包含细胞或包含两个细胞的droplets。

STAR比对

STAR比对的优点有考虑到了剪切体，输出文件内容丰富，（可以进行下游融合基因的分析，bulk seq可以）缺点是耗费计算资源。

比对的步骤首先需要构建参考基因组或转录组的index文件，由于考虑到练习运行时间，这里提供的代码是比对到参考转录本

  • Make index
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mkdir indices
mkdir indices/STAR
STAR --runThreadN 4 --runMode genomeGenerate --genomeDir indices/STAR --genomeFastaFiles Share/2000_reference.transcripts.fa

  • alingment

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    mkdir results
    mkdir results/STAR

    STAR --runThreadN 4 --genomeDir indices/STAR --readFilesIn Share/ERR522959_1.fastq Share/ERR522959_2.fastq --outFileNamePrefix results/STAR/

Kallisto 比对（Pseudo-Alignment）

Kallisto比对也称为pseudo-alignment（假比对）,即它的比对方法和STAR不同，不是将完整reads比对到参考转录本上，而是将kmer(特定长度的序列)比对到参考转录本上。

k-mers和reads相比的特点是：

  • 快
  • 处理测序error的能力强于传统的比对工具
  • 与STAR不同的另一点Kallisto是比对到转录本的

Kallisto’s pseudo mode

专门为scRNA-seq设计的，

index

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mkdir indices/Kallisto
kallisto index -i indices/Kallisto/transcripts.idx Share/2000_reference.transcripts.fa

Kallisto Pseudo-Alignment

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mkdir results/Kallisto
kallisto pseudo -i indices/Kallisto/transcripts.idx -o results/Kallisto -b batch.txt